非常に良いマグネットスタンドをつくる

Agencourt Ampure XPやDynabeadsをはじめとする磁気ビーズですが、スタートマテリアルの微量化していく際問題になるのが、マグネットスタンドとの相性です。

理想的には、液量が少ないときでも、磁気ビーズの取りこぼしがなくハンドリングが容易なように磁気ビーズが良い位置でつくことが重要です。

そのようなマグネットスタンドが売っていればいいのですがなかなか無い。次世代シーケンス用のライブラリ作製などでは、人間の手で高精度なままハイスループット化することが求めれれていますが、微妙なさじ加減がきいたよいマグネットスタンド（0.2ml PCR tube用）がないのです。

機械を導入して高精度にハイスループット化するという方向性もありますが、導入価格が高く、機械でやるにしても良いマグネットスタンドは重要です。

理想としては
１．マグネットが強い（表面磁束密度。強ければ強いほどよい。）
２．マグネットの配置が良い（チューブとの位置関係。少量の場合、低い位置が望ましい。）
３．マグネットの形が良い（リング型と人間の相性は悪い。側面式が望ましい。）
４．8連を1setとする。

自分で作るのもいいのですが、いちど良い型を作ってしまえば商品化して他のユーザーに作ってもらうことも可能なので業者さんと一緒になって今作っています。

Prototype 1号ができたのですが、
他社の8連PCR用マグネットスタンドと比べて
吸着力と位置取りが半端無く良いものになってます。

そのうちYoutubeでアップします。

微量DNAからのライブラリ作製のストレスが大幅に減りそうですね。。。

次の職

次の職が決まりました。

HiSeq 1500 memo

<HiSeq 1500 Rapid mode (2 lanes) SE51bp>
Time: 10 hours
Reads: 300 M reads / Run
Cost: about ¥190,000-250,000 / Run

<MiSeq SE51bp v2>
Time: 5.5 hours?
Reads: 15-17.5 M reads / Run
Cost: about ¥100,000 / Run

どっちも早く使いたい。2012/11/28

LIMprep: a highly-sensitive multiplex library preparation method for low amount DNA (English version)

I established LIMprep (Ligation-based Illumina Multiplex library PREParation): a highly-sensitive multiplex library preparation method for low amount DNA. LIMprep requires 4-6 cycles of PCR enrichment for 10 ng DNA, although previous methods require 10-15 cycles of PCR enrichment.  For 100 pg DNA, LIMprep require 10 cycles of PCR enrichment. LIMprep is advantage in quantitative performance. Please see the spec of LIMprep. The protocol of LIMprep is available via NipponGenetics. If you interest, please contact them at first.

*Relation to Single-cell RNA-seq*

We established novel whole-transcript amplification method. After amplification, we got ng level of cDNA. Amplified cDNA was prepared to library DNA with the  LIMprep method. 

*Confirmation by other group*
Sequence service unit already use LIMprep for ChIP-seq. Their sequence was pretty good. 

Memo: Structure of amplified cDNA of Smart-Seq

5’ AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATGGGNNNNNNNNNNBAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGTACTCTGCGTTGATACCACTGCTT 3’

3’ TTCGTCACCATAGTTGCGTCTCATGTACCCNNNNNNNNNNVTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCATGAGACGCAACTATGGTGACGAA 5'


デフォルトSmart-Seqの全シーケンスリード数の(完全マッチで)20-25%がWTA adaptor sequence 由来でした。

Illumina社のmultiplex-ChIP-seq kitについて

2012/8/21 Illumina社からTruSeq ChIP Sample Prep Kitが発売されました。　multiplex paired-end sequenceができるChIP-seqキットになったようです。PCRサイクルは18のままと感度の向上はさして無い模様です。　我々の方法だと4-6サイクルくらいのPCR増幅と非常に感度はよいです。使っているアダプターもTruSeqなので、新しく導入するならどうぞ私の方法をお使いください。

限られた予算・貴重なDryの解析を最大限活かすためには、やはりWet側のライブラリ作製での頑張りが重要なのではないかと思います。ライブラリ作製での情報の歪みの解消につながれば作った側としても嬉しいです。

LIMprep：0.1-10 ng のDNAをターゲットにしたイルミナ用マルチプレックスライブラリ作製方法

＜背景＞
2012/7現在、Illumina flowcell v3では１レーンあたり、1.8億リード場合によっては2.8億リードもの巨大なデータが排出されます。しかしマルチプレックスが出来ないと、1サンプルを1レーンでシーケンスすることになるので、リード数がさほど必要のないシーケンスにとっては非常に無駄が多くなります。というわけでマルチプレックス化は重要です。ご存じの方も多いですが、MBDP DNAやChIP DNAといった0.1-10ngの微量サンプルをターゲットとするmultiplex対応のChIP-seq sample prep kitがIllumina社からは公式には売りだされていません。今回、私は自作のTruSeqアダプターとKAPA library preparation kitを組み合わせた、高感度でロバストなマルチプレックス対応のライブラリ作製法 (LIMprep: Ligation-based Illumina Multiplex library PREParation) を開発しました。

＜方法のスペック＞
断片化された10ng のDNAをスタートマテリアルとした場合、PCR cycleは4-6サイクルで十分です。これまでの方法だと10-15サイクル必要だったことを考えると高感度です。LIMprepは安定したライブラリDNAの収量・分布、正確なコンテンツが特徴です。日本ジェネティクスさんのアプリケーションノートにスペックをアップしました。方法に興味があれば、日本ジェネティクスさんを通じた方法のアクセスを可能にしたのでアプリケーションノートの連絡先に連絡してください。

＜Single-cell RNA-seqとの関連＞

Single-cell transcriptomeでは多数の１細胞を解析するためのハイスループット化が重要になってきます。LIMprepはIllumina HiSeqによるハイスループット検出のために立ち上げました。独自に開発したWTA方法により得られた高品質な増幅cDNAをLIMprepでライブラリ作製をして、HiSeqによりハイスループット検出することに成功しています。

*注釈*
一般的に1細胞は、おおよそ10pgのtotal RNA, 0.1pgのmRNAしか持ちません。RNA-seqのスタートマテリアルには、おおよそngオーダーのDNAが必要で、Single-cell RNA-seqには量的な問題を解決するためWTA: Whole-Trascript Amplificationが必要です。WTA後にはngオーダーの増幅cDNAが得られます。

＜User・導入実績＞
サービスユニットを含めた複数のユーザーが使用しています。安定稼働中です。