KAPA Real-Time Library Amplification Kit - Kapa Biosystems 代替手段について

LIMprepやLIMprep2というdsDNAをsequence library DNAに変換するための方法というのを以前公開しました。ラボからダウンロードできる状態にあります。http://bit.riken.jp/protocols/

一方で、このプロトコル内で使っているKAPA Biosystems社の
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KAPA Real-Time Library Amplification Kit
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ですが販売停止になってしまったようです。ユーザーさんからフィードバックを受けた知り合いのディーラーさんから連絡を受け初めて知りました。なんと。
自分らのラボではストックがあったので気づきませんでした。

代替手段が無いわけではないのでここにやり方を記載しておきます。

KAPA Real-Time Library Amplification Kitは、qPCRをベースとした方法でLibrary DNAのPCR増幅サイクル数を検出するためのキットです。つまりqPCRができるための蛍光試薬があれば簡単に代替できます。以下が自分で検証した方法です。

EvaGreen
http://www.cosmobio.co.jp/product/detail/00990009.asp?entry_id=3650
KAPA HiFi HS ready mix
http://www.n-genetics.com/product_detail.html?item_id=4093
まず上記の製品を購入し、

KAPA Real-Time Library Amplification Kitを使うパートを上記に置き換えると良いです。

2xKAPA HiFi HS ready mix     5uL
10uM TPC mix     0.35uL
Nuclease free water     2.15uL
20x EvaGreen     0.5uL
Adaptor ligated DNA     2uL
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total volume 10uL

検出条件等は変わりません。

注意点ですが、ディスコンになったキットには、蛍光スタンダード4種類がついていました。これは今のところどうやってつくるか検討していません。やればできそうですけど。。。

つまり増幅曲線をみて一度ライブラリDNAを作って頂き、収量との相関を見てみるという作業が必要かもしれません。個人的には、増幅曲線での上がり始めと終わりの中間あたりのPCRサイクルを採用するのは無難かもしれないと思います。