(続) 開発で感じること

2017/05/02 修正・追記

前回にも記載しましたが、たぶん1細胞やそれ以外もそうでしょうが複数名以上で進める開発プロジェクトは、何をゴールとして　それぞれがどこをパートして　全体どれ位までいけばOKとして　いつまでに達成するのか決め、都度進捗状況を確かめるとともに労力が足りているのかを確かめる事が必要だと思います。

ミーティングで、単なる行為の報告をしても悪くはないのですが、そもそも目標をどれ位達成しているのか？その目標期間で終わるのか？労力が足りているか？目標の具体的な表現手段についても共有されているか？これらがうまく行かなかったら手を引くのかさらに労力をかけて進めるのか？などが議論されていないと、すくなくとも私には難しいです。そのプロジェクト。

基本的には、関わったプロジェクトに限らず、皆にうまく行って欲しいとおもっています。ただ最近、自分には限られた時間しか無いことを痛感します。限られた中でどのように成果を上げるのか？関わったり・下支えしたプロジェクトが上手くいくのか？そもそも自分の貢献はどこなのか？お手伝いやノウハウ伝えだけになっていないのか？

うまくいくか行かないかは研究だからわからないけど、目標・ゴールに達成しないときは、少くても精算はした方がいいと考えられる。うまく行った時、追加で目標・ゴールを変えるときも同じように考え直したほうがいいと考える。そもそも目標を達成するために刻むのと、ゴールや目標を変えるのは全く意味が異なりますし、その途中や論文執筆で　ゴールを変えたもしくは変わっても、dataや方法が変わるわけではない。また、其のような実験デザインで進めているわけではないので、変更した目標・ゴールに即していることはまれなのですぐには言えないはずです。　ゴールに合わせた開発・解析・実験が必要になり、つまり労力の追加がされるとともに、趣旨が変わるのでそれまでのデータは使えなかったりする。そこから開発がはじまり、長大な時間がかかると推測される。これはしんどい。単位時間あたりの開発力が上回らないと、結局は競争に負けるわけだし、たんに時間を積めばいいわけでもないと考えられる。前目標で少なくともある程度疲弊した状態で新目標を達成できないようなきがする。どこかで切り替えが必要だと思う。何らかの形で。契約書作って、変わったら再契約もしくは精算っていうノリが近いとおもう。

無限にプロジェクトに複数名の労力をかけ続けるのは無理だろう。プロジェクトに関わった人に期限内に労力に見合った成果が帰っていくようなことを日々目指している。研究の持続可能性は、個人の幸せからもくるとおもうから。

(Q&A) DNase I treatment for RNA purification

2回くらい訊かれたのでココに記載しておきます。

Q: RNA-seq用に使用するtotal RNAだが、column精製による抽出時にDNase I処理した方がいいか。

A: 処理をお薦めします。よいcolumn精製だと殆ど入ってきませんが、qPCRなど高感度なアプリケーションには2度DNase I処理する場合もあります。また難しいサンプル1細胞あたりのtotal RNAが少ないものでは、相対的にgenomic DNAがおおくなり、genomic DNAの比率が高くなる危険性が有る。1細胞あたりのtotal RNAを計算しようとする場合だと、オーバーエスティメートしてしまいます。難しいサンプルのはずなのに、total RNAが多いとミスリードして1細胞RNA-seqが失敗する可能性もあります。bulk poly-A RNA-seqですと、そもそもoligo-dT beadsでキャプチャーするので原理的に除かれてしまうとおもいますが、高感度なアプリケーションではあるので、やっておいたほうが無難だと思います。

1細胞ゲノミクス手法の開発に必要な単位

はじめに
あくまで個人的な感想ですが、1細胞ゲノミクス手法の開発に必要な単位が有るように感じ、それから外れたものはうまくいかなかったもしくはいかないような気がします。何か法則性がないのかなと引っかかるところがあったので、気づいた部分を忘れないために書いておきます。

現在、single-cell RNA-seqを含む1細胞ゲノミクス手法の開発は、実験手法の開発だけでなく、解析手法の開発競争も苛烈さを増しており、よりチームで体制を整えて戦っていかないと個人ではとても勝てない状況になっていると感じられます。

2010年頃、Quartz-Seqの開発を始めた頃、現在のような競争速度はなく、ある程度、個人研究の範囲内で、実験手法の開発はでき、解析者との共同研究もうまく行ったので、2013年に論文を発表することが出来たが、現在おなじような開発スケジュールや体制で進めたら勝つことは出来るのか疑問です。

上記にimageする最小単位や影響するファクターとその影響度合いの個人的な印象をざっくり書いてみました（赤枠は必須）。必須な部分をおさえつつ、ある程度の開発速度を持っていかないと世界と戦えないという点はかわりませんが、開発速度に影響を与える効率に関しては個人の能力やエフォートなど様々なファクターに影響するので、値はあくまで印象です。

両者（実験研究者と解析研究者）が必要
1細胞ゲノムクス手法の開発ですが、より解析手法を把握した上での実験手法の開発がないと、最終的にバイオロジカルな情報を引き出す上で最適な実験手法の開発になっておらず、十分で有効な手法になっていないということが容易に想定され、結果、最終的によい方法にならない可能性が高まる。つまり実験手法開発の初期の段階から、解析研究者とタイトに組んだほうが良いし、両者（実験研究者と解析研究者）が必要です。また両者がそれぞれある程度のエフォートをかけることが必須でしょう。

両方デキる人が1人いれば十分ではないか？という問いに対しては、解析・実験手法開発を直列に繋いですすめるので、遅くなってそれでも先をこされないオリジナリティーの有るものであれば可能かもしれません。ただし、1細胞ゲノミクスの分野は非常に込み合っており、同じようなアイデアを持って進めている人がいる確率はとても高いです。そうなった場合、開発スケジュールの早い体制を作ったものが勝っていく、開発効率の問題になります。オンリーワンの分子生物学的コア技術を作って、速度競争から逃れたいとは思っていますが、完全に逃れることはなかなか難しいとも感じます。最低1人ずつ必要で、それができたとしてもまだ海外での人材投入規模との乖離は大きいようにもみえる。

実験テクニカルスタッフの必要性
両者（実験研究者と解析研究者）が必要ですが、それに加えて、実験テクニカルスタッフもやはり必要だと思います。実験手法の大枠などは、研究員が作り上げる必要がどうしてもありますが、方法のロバストさを上昇させるためのブラシアップといった部分の労力も多くかかり、この部分を担当する実験テクニカルスタッフがいないと多くの時間がかかります。イーコール：開発速度が遅くて先を越される可能性が高くなる。ということだとおもいます。いないと1.5倍以上かかるのではないでしょうか？実験研究者が手を動かせず指示だけ出すようなスタイルを取るのであれば、そもそも開発が成り立たない場合もあるでしょう。成り立ったらすごいとおもいます。

世界と戦えるタイムスケジュール
世界と戦える開発タイムスケジュールはどうあればいいのか？フィーバーして人材もお金も投入されて激混みしている1細胞の場合、それに見合った開発速度があるはずだと思います。そこで成果を出すのであれば。その速度が少しでも世界より遅いと、後追いになり論文がでにくくなり、その次の論文にも影響し、っと1度まけると次に勝つのがどんどん難しくなっていくと感じます。実験開発のプロトタイピングという意味では、半年以内が目安になるかもしれません。後述する出来上がったパーツパーツを組み合わせて方法を組み上げていったとしても、方法の枠組みが出来るのに最低数ヶ月はかかり、ブラシアップにも時間がかかることを考えると半年かかるかと。ここに影響するものとして、プロトタイピングで使用する方法のパーツパーツのノウハウが蓄積していないと、プラス半年かかると思います。半年ほどで、論文のfigに使用できるくらいの最初のdataを、解析研究者に受け渡せるくらいのスケジュールが目指せると、戦えるイメージが持ててくる。そこからはData出し、検証、論文化とすすめていく。

後追い
最初に荒くてもPOCを示した方法が出てしまうと、たとえその方法がとても使いにくく問題があった方法であったとしても、後追いになると、要求されるdataがとても多くなります。これは、どの品質で出すかという点も影響すると思いますが、開発速度を保つこと前提で、加えてスケジュールを区切ってしまわないと、後追いになる確立が上昇していき、より多くの労力を割くことにつながる。つまり消耗し未来の研究をスタートする時期が遅れます。

シーズおよびノウハウの蓄積の重要性
1細胞ゲノミクス手法は複数のパーツから成り立ち、そのパーツパーツのノウハウを蓄積しておくと、開発完成までの期間を短くすることは上述のとおりです。でもこのようなノウハウの蓄積はある程度、日々やっておかないと、一朝一夕に揃えることは出来ません。技術の動向やその導入などでは使えるパーツの選定ができるでしょうし、パーツ自体をつくるということに労力を割いてオリジナルパーツをつくれば、ひいては高いオリジナル性を持った方法になる確率が高くなる。後述の部分はとくにシーズとなる技術の芽をだすものなので、継続した注力が望まれる。それが持続可能な技術の改善・刷新を支えると自分は思います。2回目からはノウハウなどのベースラインを活用しつつ技術開発できるから、最初よりもコストが低くなる点も是非活かしたいです。

自分なりのまとめ
開発を開始するにあたって、個人的な感想だが、上図（必要な最小単位）の部分が足りているのか見たほうがいいとおもう。上図の体制の部分に当てはめた際に、足りない部分があった場合、其のプロジェクトは多分うまくいかない可能性がとてもたかいと思う。開発効率・速度の問題が大きいので、きちんとその速度を定量化して可視化し、足りてないなら、単位時間あたりの開発量をあげたほうがいいのではないだろうか。

おわり
1細胞での開発速度から以上を感じたが、べつに他の研究でもそれはそうだしなぁ。　なにあたりまえのこといってんの？って感じの印象になりましたが、自分なりには現時点の印象をまとめられてすっきりしました。

Erratum to Quartz-Seq paper

Previously, we reported single-cell RNA-seq method, Quartz-Seq. Recently, we noticed some errors in the original paper. Therefore, we reported the correction about Quartz-Seq paper. I apologize for these errors.

https://genomebiology.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13059-017-1154-x

KAPA Real-Time Library Amplification Kit - Kapa Biosystems 代替手段について

LIMprepやLIMprep2というdsDNAをsequence library DNAに変換するための方法というのを以前公開しました。ラボからダウンロードできる状態にあります。http://bit.riken.jp/protocols/

一方で、このプロトコル内で使っているKAPA Biosystems社の
```
KAPA Real-Time Library Amplification Kit
```
ですが販売停止になってしまったようです。ユーザーさんからフィードバックを受けた知り合いのディーラーさんから連絡を受け初めて知りました。なんと。
自分らのラボではストックがあったので気づきませんでした。

代替手段が無いわけではないのでここにやり方を記載しておきます。

KAPA Real-Time Library Amplification Kitは、qPCRをベースとした方法でLibrary DNAのPCR増幅サイクル数を検出するためのキットです。つまりqPCRができるための蛍光試薬があれば簡単に代替できます。以下が自分で検証した方法です。

EvaGreen
http://www.cosmobio.co.jp/product/detail/00990009.asp?entry_id=3650
KAPA HiFi HS ready mix
http://www.n-genetics.com/product_detail.html?item_id=4093
まず上記の製品を購入し、

KAPA Real-Time Library Amplification Kitを使うパートを上記に置き換えると良いです。

2xKAPA HiFi HS ready mix     5uL
10uM TPC mix     0.35uL
Nuclease free water     2.15uL
20x EvaGreen     0.5uL
Adaptor ligated DNA     2uL
----------------------------------------------
total volume 10uL

検出条件等は変わりません。

注意点ですが、ディスコンになったキットには、蛍光スタンダード4種類がついていました。これは今のところどうやってつくるか検討していません。やればできそうですけど。。。

つまり増幅曲線をみて一度ライブラリDNAを作って頂き、収量との相関を見てみるという作業が必要かもしれません。個人的には、増幅曲線での上がり始めと終わりの中間あたりのPCRサイクルを採用するのは無難かもしれないと思います。

完全版 96 well magnetic plate

日本ジェネティクス社と相談し、完全版の96 well magnetic plateを作ることが出来ました。完全に微量用になってます。容量が多いもの70-100ul以上は逆に吸着に時間がかかりますが、微量には強いです。デメリットだった、磁石の競合はなくなっています。2人の方に指摘されたのが気になって改善してみました。結果的に非常に良くなったと思います。運用して問題なさそうなので、公開しておきます。市販されてるわけじゃないですけど、日本ジェネさんに言えば、作ってくれると思います。興味がもしあれば彼らに相談してください。　評価結果はこちら。

日本ジェネティクス社96 well Magnetic plateの使い方

日本ジェネティクス社から売られている96 well magnetic plateですが、結構良く出来ているのですが若干クセがあります。BiTでの現状の使い方をまとめてみました。完璧無欠にするのは難しいですね。

CLCを用いたde novo assemly

自分のmac book proでde novo assemlyできる限界はPE171 10-20M readsくらいか。それ以上はメモリが厳しい。リードが少なくても発現量が高い遺伝子はde novo RNA-seqで十分取ってくることができる模様。degenerate PCRなどの方法でホモログ取るよりはるかに簡単で早いし、ほぼfull length。もちろんRNA量あたりの遺伝子発現量によるのでしょうね。

微量サンプル用の96 well magnetic plate

これまでに、日本ジェネティクスの角川さんと一緒に、8連用で微量サンプル可能なマグネットスタンドを開発した経緯があり、該当物は既に購入可能となってます。

一方で、96 well用の手動で微量サンプル可能なものはありませんでした。
日本ジェネティクスの角川さんと開発進め、
今回、96 well PCR plate用の磁気プレートが完成しました。

5 ulのボリュームで精製可能。
Full skirted PCR plate, non-skirted PCR plateともに対応。

外観はこんな感じ。アルミの光沢が綺麗。

プレートを装着するとこんな感じ

Eppendort, 0.2 ml non-skirted

Eppendort, 0.1 ml non-skirted

Eppendort, 0.1 ml skirted

BioRad, 0.1 ml skirted

底面からの観察。
強力なネオジウム磁石が、チューブ側面にピッタリ配置するように設計。
底面から数mmでかつ側面に磁気ビーズを保持することができるように設計。

non-skirted PCR plateを使った場合でも、

黒いイモネジによってXY軸のブレを防止。

側面のネジを緩めることで、磁石のついた棒を外し洗浄することが可能。

5ul, 10ul, 15ulの磁気ビーズをくっつけた場合。
溶液を吸っても磁気ビーズは全く動かない。

完成。

購入も可能になったようです。以下情報まで。

製品名：NGS　MagnaStand96（YS－Model）　
型番：＃FG-SSMAG96
会社：日本ジェネティクス

所属ラボでの人材募集

所属するバイオインフォマティクス研究開発ユニットでテクニカルスタッフさんの募集を開始しました。以下が詳細です。募集人数は、実験系と解析系で各1名です。

http://www.riken.jp/careers/researchers/20140520/
http://www.riken.jp/careers/researchers/20140520_2/

Quartzのことを書いてますが、それ以外にもいろいろ技術作ってます。
最先端の技術を習得したり、面白いデータに触れる機会が多いとおもいます。
ほんとこんな時期ですが、募集があればこれ幸いですね。

ラボは男子率というか
（この歳だとおっさん率か）
が高いです。

所属長もTwitterで書いてますけど、
子育てしながらラボに参加している人が多いです。自分もそうです。
なので子育てしながら働くうえでの心配はないかとおもいます。

人がベストなパフォーマンスを発揮するのは
気持よく働けている時だと思います。

ご縁があれば、各人に最適な働き方で
ラボに参加してもらえるといいですね。

人材は唯一無二だなぁ。

1細胞関連の科研費

1細胞関連増えましたかね？

CREST、さきがけもでてますしね。

http://kaken.nii.ac.jp/p?q=%E4%B8%80%E7%B4%B0%E8%83%9E

http://kaken.nii.ac.jp/p?q=%E5%8D%98%E7%B4%B0%E8%83%9E

http://kaken.nii.ac.jp/p?q=1%E7%B4%B0%E8%83%9E

ことしから以下の課題を進めようと思います。

1細胞マルチオミックス技術の開発

Quartz-Seq protocol文章訂正と追記

Quartz-Seqのプロトコルに一部誤字があったので訂正しました。
またよく質問を受けるPCRプライマーの修飾の種類とメーカー情報に関して追記しました。
訂正版は、これまでと同じく所属ラボRIKEN ACCC BiTからダウンロードできます。
http://bit.accc.riken.jp/protocols/

• Whole-transcript amplification for single-cell Quartz-Seq (PDF)
• Whole-transcript amplification for cell-population Quartz-Seq (Cell Direct Version)
• Whole-transcript amplification for cell-population Quartz-Seq (Purified RNA Version)

追記部分以下の通り。
<PCR primer information>
I used NH2(C6) amination as 5' modification for suppression PCR primer. The amination block the ligation between WTA adaptor and Y-shaped sequence adaptor. Aminated oligo (from some maker) became small size ladder DNA in PCR step. Non-aminated oligo never become ladder DNA. The ladder DNA may affect sequence reads. I don't know the mechanism of ladder DNA synthesis from aminated oligo DNA. On the other hand, Sigma Aldrich oligo and Takara-clontech oligo become few amount of ladder DNA. Therefore, we recommend Sigma Aldrich oligo or Takara-clontech. If you use Nextera system or Nextera XT system for Illumina sequence library preparation using amplified cDNA, you do not need 5' amination for suppression PCR primer.

Tagging primerとPCR primerをまちがって使っちゃった人いたらごめんなさい。

20130904_Quartz-Seq開発_NGS現場の会 第三回研究会_プレゼンテーション

20130904にNGS現場の会で発表しました。

これから1細胞RNA-Seqを始める研究者が、
実験で躓かないようできるだけ失敗例も交えながら紹介しました。

ここからダウンロードしてみることができます。
pdfファイルでちょっと重いです。
「1細胞Quartz-Seq法誕生までの開発の道のりと今後の展開」

製品版 NGS MagnaStand 8Ch の動作確認

製品版 NGS MagnaStand 8Chでは、若干プロトタイプと比べてフォールドを固くする調整がされているようです。なので動作確認してみました。

0.2 ml 8連PCRチューブに
5 ul, 10ul, 2ulのマグネットビーズ液を入れて
結合した写真が以下のとおりです。










プロトタイプと比べて、磁石の位置が
低ボリュームにより対応していることがわかります。
すこし固めに設定されているのでPCRチューブが動くことはありませんでした。

プロトタイプよりこっちがよいですね。

会社: 日本ジェネティクス (http://www.n-genetics.com/contact.html)

商品番号: FG-SSMAG

商品名: NGS MagnaStand 8Ch（YS-Model)

価格: ￥47,000

Quartz-Seq用のライブラリ作製方法LIMprepにおける注意点

以前から配布しているシーケンスライブラリ作製の方法LIMprepのプロトコルに関してですが、これは微量なdsDNA用に作ったものでQuartz-Seq用のLIMprepでは若干プロトコルが違っています。ですのでQuartz-Seq用のLIMprepで間違いがおきないために配布します。よろしくお願いします。違うところは精製の部分です。

なぜ違うかは以下詳細です。
・・・・・・
Quartz-Seqでは増幅したcDNAをCovarisによって断片化していますが、理由があって非常にきつい条件で行なっており、短い断片化されたDNAが出てきます。論文にもちょっと書きましたが、原理的には短いトランスクリプト由来cDNAのほうが長いトランスクリプト由来cDNAに比べて、シーケンスライブラリ作製に有効な断片化DNAが出てきにくいという特徴があります。cDNAの両端はアミノ化されておりライゲーション反応にかからないよう設計されており、両端が断片化によって生まれたものがライブラリ作製にかかるという寸法であるので、長いDNAから二箇所切れるより、短いDNAから二箇所切れるほうが難しいというだけのことです。そのためできるだけ短いものからも有効な断片化DNAをえたいがために、きつい断片化の条件になっています。

短いトランスクリプトの検出感度上昇を期待しているということです。

Agencourt Ampure XPの通常の精製法では、短い断片化DNA < 100 bpはロスしてしまうため、Quartz-Seq用LIMprepではAmpure XPはサイズセレクションしか使っていません。またサイズセレクションですが、サイズセレクションしたい液のボリュームに対して当量のAmpure XPを加えるというのが一般的ですが、それでは短いインサート由来のシーケンスライブラリDNAが除かれてしまいます。DNAの分布が精製後変わらないように、1.2倍もしくは1.4倍のAmpure XPを加えるように改変しています。
・・・・・・

NGS MagnaStand 8Ch for 2-6 ul ultra low volume

NGS MagnaStand 8Chが2-6 ulという微少ボリュームでも機能するか試しました。少しコツが必要ですができることがわかりました。磁気ビーズを保持したまま、ほとんどの液を回収することができました。0.1 ml PCRチューブを使う必要があります。

動画は以下から見ることができます。
https://www.youtube.com/watch?v=KtgNrGhIKto

---------------------------------------
会社: 日本ジェネティクス (http://www.n-genetics.com/contact.html)
商品番号: FG-SSMAG
商品名: NGS MagnaStand 8Ch（YS-Model)
価格: ￥47,000
---------------------------------------



I tested whether "NGS MagnaStand 8Ch" work for ultra low volume (2-6 ul) or not. As a result, "NGS MagnaStand 8Ch" work well for ultra low volume (2-6 ul).

Please see the movie.
https://www.youtube.com/watch?v=KtgNrGhIKto

---------------------------------------
Company: Nippongenetics (http://www.nippongenetics.eu/contact/)
Product number: FG-SSMAG
Product name: NGS MagnaStand 8Ch（YS-Model)
Price: ￥47,000
---------------------------------------

Quartz WTA protocol for 100 pg - 1 ng total RNA

集団サンプル用のQuartz増幅プロトコルを公開しました。以下ダウンロード出来ます。

I prepared two type of Quartz WTA protocol for 100 pg - 1ng total RNA.

Whole-transcript amplification for population Quartz-Seq (vCellDirect)

Whole-transcript amplification for population Quartz-Seq (vPurifiedRNA)

微量サンプル用マグネットスタンドの商品化

ルーチンに微量サンプルから次世代シーケンス用のライブラリ作製する際に、マグネットスタンドの磁力・位置に問題・ストレスを感じ、微量サンプルに向いたマグネットスタンドがなかったので、日本ジェネティクス社のすみかわさんと相談し商品化までして頂きました。自分が困って自分のために作ってもらいましたが、良い物なのでおすすめできるかなと。興味があれば以下購入可能です。

  型番；FG-SSMAG
  品名；NGS MagnaStand 8Ch（YS-Model)
  定価；￥47,000-

既成品と比べてNGS MagnaStand 8Chは早くマグネットビーズを集めることができ、少ないボリュームでも最適な位置にマグネットビーズを保持することができます。ストレス減少・性能向上に貢献してくれると思います。

プロトタイプを用いた、比較動画ですが以下から見ることができます。暇な時に見てください。商品の方はさらにフォールドが改善しています。

既成品 VS NGS MagnaStand 8Ch (25 ul, 50 ul, 100 ul, 200 ul)
https://www.youtube.com/watch?v=fn3dIdNY2lg

NGS MagnaStand 8Ch　(ピペッティング)
https://www.youtube.com/watch?v=A4M832Wl6n8

既成品 （ピペッティング）
https://www.youtube.com/watch?v=0WPJkHZSUpI

NGS MagnaStand 8Ch (100 ul x 8 tube)
https://www.youtube.com/watch?v=KRz2W_KgzlE

Quartz WTA protocol (Original)

Single-cell Quartz-SeqのcDNA増幅(Whole-transcript amplification)のプロトコルをダウンロード出来るようにしました。ラボホームからもダウンロード出来ます。活用してください。

I prepared Quartz WTA protocol for enduser. You can download Quartz WTA protocol (Original version).  Good luck with your single-cell project. 

Quartz-Seqの名前由来

Quartz-Seqは2013/4/23現在、最も感度が高く最も再現性の高い1細胞RNA-Seq法です。実験手法の開発では、定量性を上げることを主目的に、問題となるパラメータを全てあぶりだし、改善をはかりました。刀鍛冶が刀を鍛えるイメージです。ひたすら切れ味＝定量性を求めました。データ解析のプロとがっちり組んで開発したことで総合的に完成度の高い方法になったと思います。実験研究者として、実験手法を開発し世に送り出せたことは非常に喜ばしいことです。

Quartz-Seqの名前の由来の話ですが、Quantitative amplification for RNAzの略がQuarzで、英語でのQuartzのドイツ語表記となります。zはギークでsをzという場合があるから置換して使っています。Quartzは水晶やクオーツ時計といった意味合いがあり、正確性をイメージさせる名前となっています。

正直、かっこいい名前をつけるのは苦手です。ただ方法の名前に自分の名前がつくのだけは嫌だし、つけないと方法が出た時ユーザーが呼びづらく混乱のもとなので、二階堂さんにつけてもらいました。スキャッタープロットが綺麗だからその形から方法の名前を考えたり、方法の特徴から考えたり、イメージで考えたりと、二転三転なかなか決まらなかったのを覚えております。

Quartz-Seqで使用している増幅法は、poly-A tailingをベースとしており、同カテゴリーには、 斎藤通紀先生のラボで作った栗本法や栗本法をベースに作ったAzim Surani博士の研究室のTang法が含まれます。栗本法は、1細胞レベルの10 pg total RNAを用いて、きちんと1細胞トランスクリプトームでの方法の再現性を示した最初の方法です。再現性が比較的高い一方で、方法が少々複雑でありました。なのでQuartz-Seqの開発では、簡便性・ロバストネスを併せ持ったまま定量性を上げていきました。実験手法の開発の実働は私一人です。人を倍に増やしても開発が必ずしも進むわけではないことを実感しました。

Quartz-Seq の論文では、サプリメントがいっぱいあります。

Figure S1-18とTable S1-3、S-movie1&2で合計25個ですね。

これまでの1細胞RNA-Seqの手法では、中身のパラメータがどれだけ方法のスペックに貢献しているかや実際にどのように細胞をとっているかなど細かい部分がほとんど提示されていませんでした。すべてのパラメータを開示することでユーザーに納得してもらうとともに、今後の特に1細胞RNA-Seqの開発の後押しをするものとして期待しています。

これらマニアックなサプリを読む人は、絶対マニアックな人だと思いますが、そういう人に見てもらえると嬉しいです。